用荧光原位杂交技术解码基因图谱

随着原位杂交技术的引入，细胞遗传学进入了分子时代，原位杂交技术使研究人员能够定位染色体上特定DNA序列的位置。自 1969 年首次原位杂交实验以来，该过程的许多变体已经被开发出来，其灵敏度也大大提高。如今，大多数原位杂交程序使用荧光探针来检测 DNA 序列，该过程通常称为荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）。细胞遗传学家可以使用多种 FISH 程序来诊断患者多种类型的染色体异常。FISH 以及所有其他原位杂交方法的成功取决于DNA双螺旋的稳定性。

荧光原位杂交

荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种分子遗传学技术，原理是采用荧光染料标记的DNA 探针与组织细胞中待测的核酸按碱基配对原则进行特异性结合，通过荧光显微镜检测信号得出结果，从而检测细胞和组织样本中的染色体和基因异常。FISH 技术几乎可以快速检测任何类型组织细胞的染色体异常，不管组织是新鲜的或是一些甲醛溶液(福尔马林)固定的陈旧组织标本。

FISH被广泛接受用于乳腺癌、肺癌、膀胱癌、宫颈癌、淋巴瘤等实体瘤的辅助诊断，其目的主要集中在对肿瘤的早期诊断、疗效检测、个体化治疗和预后判断等几个方面。FISH 作为一项很重要的分子遗传学检测技术，在血液肿瘤的诊断中也有很大的作用，得到了NCCN 等国内外各大血液肿瘤诊疗指南的认可和建议。目前与血液肿瘤相关的FISH 探针有接近100 种，常用的就有60 种左右，包括急慢性白血病、骨髓增生异常综合症（MDS）、多发性骨髓瘤（MM）、淋巴瘤等多种血液肿瘤。

荧光原位杂交的原理

在分子杂交中，标记的 DNA 或RNA序列用作探针来识别或定量生物样品中序列的天然对应物。20 世纪 60 年代，研究人员 Joseph Gall 和 Mary Lou Pardue 意识到分子杂交可用于鉴定 DNA 序列的原位位置（即染色体内的自然位置）。

Gall 和 Pardue 的工作完成后不久，荧光标记迅速取代了杂交探针中的放射性标记，因为它们具有更高的安全性、稳定性和易于检测性。事实上，当前大多数原位杂交都是使用 FISH 程序完成的。

该过程的第一步是制作探针序列的荧光副本，或探针序列的修改副本，该副本可以在稍后的过程中呈现荧光。接下来，在发生任何杂交之前，必须用热或化学物质使靶序列和探针序列变性。这种变性为了在随后的杂交步骤中在靶标和探针之间形成新的氢键，该步骤是必要的。然后将探针和靶序列混合在一起，探针与染色体上的互补序列特异性杂交。如果探针已经发出荧光，则可以直接检测杂交位点。在其他情况下，可能需要额外的步骤来可视化杂交探针。探针与其染色体靶标之间形成的杂交体可以使用荧光显微镜进行检测。

当研究人员设计 FISH 实验时，他们需要考虑实验所需的灵敏度和分辨率是否在荧光显微镜的技术限制范围内。灵敏度取决于特定显微镜的聚光能力，这决定了是否可以检测到比大目标序列更难看到的小目标序列。分辨率是指沿着染色体长度区分两点的能力，光学显微镜无法分辨间隔小于 200-250 nm（可见光谱下限）的物体。考虑到这些技术限制，研究人员还需要考虑染色体内 DNA 的构象。中期染色体比间期染色体致密数千倍，而间期染色体又比裸露 DNA 致密至少十倍。当所有这些因素一起考虑时，研究人员通常期望获得中期染色体上位置的巨大碱基范围和间期染色体数万个碱基内的分辨率。

荧光原位杂交的技术优势

与其他原位杂交技术相比，荧光原位杂交的优势主要体现在：
1. FISH 技术更敏感，可检测出核型分析检测不出的细微缺失或易位，如MDS 中的5q 缺失综合征；
2. FISH 技术不需要中期分裂相细胞，而核型分析需要培养时间较长且需要较高的操作要求；
3. FISH 技术是在细胞形态的基础上进行结果判读，可有效地降低假阴性或假阳性的风险，而PCR 技术经过倍增扩增，不能在形态的基础上判读，对实验要求高，易产生假阴性或假阳性。
4. 多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列。

荧光原位杂交的应用

1. 使用 FISH 鉴定基因位置

FISH 提供了一种强大的工具来识别克隆 DNA 序列在中期染色体上的位置。从历史上看，FISH 和其他原位杂交结果在绘制人类染色体上的基因图谱方面发挥了主要作用。这些实验的结果被收集并编译到数据库中，这些信息在人类基因组计划(HGP)的注释阶段被证明是有用的。现在人类基因组测序已经完成，研究人员很少使用原位杂交来简单地确定人类基因的染色体位置。目前，人类 FISH 应用主要针对临床诊断。

2. 使用核型和 FISH 诊断染色体异常

FISH 和其他原位 杂交技术对于各种染色体异常（包括缺失、重复和易位）的临床诊断非常重要。如今，细胞遗传学家能够利用广泛的 HGP 克隆资源来精确识别核型中出现的染色体重排位点。事实上，一个科学家联盟已经将人类基因组计划中的 7000 多个 DNA 克隆映射到人类染色体上的特定条带上。

3. 使用 FISH 探针集合“绘制”整个染色体

使用位点特异性探针检测染色体重排可能是一项漫长的工作，特别是如果发生了复杂的重排或重排区域难以通过核型中的带型模式识别。幸运的是，细胞遗传学家现在可以选择使用多荧光 FISH（或光谱核型分析）来快速扫描一组中期染色体以发现潜在的重排。多荧光 FISH 生成核型，其中每条染色体似乎都涂有不同的颜色。每个“油漆”实际上是跨越特定染色体长度的序列的杂交探针的集合。

尽管染色体涂料可以快速评估中期扩散中的大染色体变化，但该方法的分辨率有限。因此，虽然染色体涂色允许研究人员快速识别涉及易位的染色体并识别大的缺失和/或重复，但小缺失和重复将无法检测到。如果研究人员需要有关染色体重排所涉及的实际序列的更多详细信息，他们需要使用位点特异性探针进行后续研究。

4. 使用 FISH 分析间期染色体

自从引入 FISH 以来，细胞遗传学家已经能够分析间期染色体以及用于核型分析的中期染色体。这提供了真正的实用优势，因为在准备染色体进行分析之前，细胞不需要培养数天或数周。此外，FISH 可用于分析实体瘤等标本的染色体，这些标本具有很大的临床意义，但不经常分裂。FISH 的另一个有用功能是，如果杂交探针标记有不同的荧光团，研究人员就能够同时监测多个位点。

间期FISH的另一项研究应用是利用染色体特异性颜料来获取有关细胞核内染色体组织的信息。通过创造性地将染色体特异性探针与基因特异性探针和抗体结合起来，研究人员可以使用 FISH 提供有关核结构的令人兴奋的新见解。

荧光原位杂交用什么显微镜

FISH样本观察主要使用正置研究级荧光显微镜，同时需要搭配高灵敏度相机和FISH图文系统来完成。对整套方案都有较高的要求，主要体现在以下几点：

1. 根据FISH染料做过优化的高品质FISH专用荧光滤色片组提供最佳的图像对比度。具有高透过率、高截止深度和高光谱陡度的优点，保证足够亮度的同时，提供最佳的图像对比度，同时还要求消除串色的影响和多色图像叠加零漂移；

2. FISH专用10x、20x、40x、100x复消色差物镜，保证FISH荧光成像效果；

3. 进口汞灯光源或者高功率多光谱LED光源，满足所有FISH染料的要求；

4. 操作简单便捷的FISH图文系统，避免繁琐的操作，节省时间，提高效率；

5. 科研级像素荧光摄像头，采用新一代大靶面和大像元尺寸sCMOS相机，保证了高灵敏度和分辨率，让FISH样本能够完美还原并保存。同时相机可满足明场样品的拍摄，可搭配FISH专用图文系统和专业显微成像分析测量系统。

浩康生物正置荧光显微镜可根据客户FISH样本需求定制最佳配置，效果基本达到进口品牌同档次显微镜，但性价比远高于进口品牌。另外，浩康生物能够提供更周到的售后服务，确保在遇到问题时能够得到及时的帮助和解决方案。

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