探秘荧光的奇妙世界：荧光知识充电站

荧光是一种分子现象，其中一种物质吸收特定颜色的光，并几乎同时辐射出另一种颜色的光。后者的能量更低，波长更长，这个过程被称为激发和发射。许多物质都具有荧光特性，包括有机物和无机物。在荧光显微镜的早期使用中，显微镜学家观察的是初级荧光或自体荧光。但是现在已经开发出许多荧光染料，它们可以发出非常明亮的荧光，并用于染色样品的特定部分。这种方法被称为次级或间接荧光。这些染料被称为荧光染料，当它们与抗体、核酸等其他有机活性物质结合时，也被称为荧光探针或荧光团。现在已经有许多荧光染料在蓝色、绿色、橙色、红色和近红外光谱范围内具有特定的辐射峰值。

01 荧光的分子机理

荧光过程分为三个阶段，所有这些事件都发生在相隔几个数量级的时间尺度上。进入光子对敏感分子的激发发生在飞秒内，而激发态电子振动弛豫到最低能级的速度要慢得多，可以在皮秒内测量。最后的过程，即发射较长波长的光子和分子返回基态，发生在相对较长的纳秒时间内。因为激发态也可以通过不涉及光发射的其他非辐射机制来弛豫，与荧光发射竞争并降低其效率，所以荧光与用于产生激发态的光子能量相比，荧光光子的能量较低。

02 荧光染料

荧光染料（或荧光团）是一种荧光化合物，可以在光激发下重新发光。荧光染料通常包含多个组合的芳香族基团，或具有多个 π 键的平面或环状分子。

荧光染料有时单独使用，作为液体中的示踪剂、作为某些结构染色的染料、作为酶的底物或作为探针或指示剂（当其荧光受到极性或离子等环境因素的影响时）。它们通常与大分子共价键合，用作亲和或生物活性试剂（抗体、肽、核酸）的标记。荧光染料主要用于在荧光成像中对组织、细胞或材料进行染色。荧光素通过其胺反应性异硫氰酸酯衍生物异硫氰酸荧光素 (FITC) 成为最流行的荧光染料之一。得益于羧基荧光素 (FAM)、TET 等，应用已从抗体标记扩展到核酸。另外其他常见的荧光染料还有罗丹明 (TRITC)、香豆素和花青的衍生物。新一代荧光染料通常表现更好，比传统染料更耐光、更亮和/或对 pH 值不敏感。以后有机会我们会专门详细来讲解荧光染料。

03 荧光光谱

荧光染料的荧光光谱是用荧光光谱仪（荧光分光光度计）测量得到的。

确定特定荧光染料的发射光谱时，需要确定最大吸收波长（常等同于最大激发波长）并在该波长下激发该荧光染料。上图a中显示了一个典型荧光染料的吸收光谱，纵坐标为吸收的相对强度，横坐标为波长。然后，我们用一个单色器（一种仅允许窄光波段通过的装置）进行扫描，得到全范围发射波长下相对应的荧光发射强度值。上图b中显示了基于各波长下荧光相对强度的测量值绘制的发射光谱。确定特定荧光染料的激发光谱时，也采用了类似的方法，即在用一组连续的波长激发荧光基团的同时，监测不同波长下的最大荧光发射强度。确定最大荧光发射强度，并只允许最大荧光发射强度对应波长的发射光通过检测器。在各激发波长下（通常通过单色器）诱导激发，并测量作为波长函数的发射荧光强度。测量结果可绘制为如上图a所示的图形或曲线，描绘了全范围激发波长光谱相对应的荧光强度。

在荧光显微镜中，激发和发射强度与波长的重叠区域（如上图c所示）必须通过选择适当的激发滤光片、分光镜（反射光荧光）和发射滤光片来消除。否则，激发光太亮会掩盖较弱的荧光发射光，从而显著降低标本的对比度。

04 荧光信号强度的影响因素

在给定的激发强度下，荧光染料所发射的荧光量受多个因素影响，其中包括：

1. 样品染色部分内的染料浓度和样本的厚度。

2. 染料的消光系数；消光系数告诉我们有多少入射光会被给定浓度的染料和给定厚度的样品所吸收，反映的是波长相关的吸收特性，由荧光染料的激发光谱表示。虽然许多荧光染料在峰值激发波长时有很高的激发系数，但实际的试样制备技术往往会限制试样中容许的最大浓度，染色标本实际吸收的总光量因而会减少。

3. 染料的量子效率；量子效率指吸收的光能与发射的荧光之比，它决定吸收的光能中有多少会转化为荧光。常见的最有效荧光染料的量子效率约为0.3，但实际值可能会因为所谓淬灭过程而降低，其中一种是光致漂白。这些因素的结合，加之许多试样的受染材料量在观察视场中非常少，使得典型应用中的发射荧光强度与激发光强度之比在10-4(极高荧光度样本)至10-6之间。现行技术 (如荧光原位杂交)使用非常少的荧光材料量，该比值可能低至10-9至10-10。

4. 显微镜视场内实际存在的受染材料量。

因此，为了能以足够高的对比度看清荧光图像，荧光显微镜必须能够在不衰减荧光信号的情况下，将激发光衰减高达10-11(针对非常微弱的荧光)。

05 荧光显微镜中的滤光片

荧光显微镜的主要滤光元件是位于荧光滤色块中的三片滤光片：激发滤光片、发射滤光片和二向色分光镜。

1. 激发滤光片：只透射照明光中能够有效激发特定染料发出荧光的光，滤色块一般根据激发滤光片的类型命名:

U 用于DAPI和Hoechst 33342等染料的紫外激发；

B 用于FITC和相关染料的蓝光激发；

G 用于TRITC、Texas Red等染料的绿光激发。

2. 发射滤光片：衰减激发滤光片所透射的所有光线并非常有效地透射样品所发射的任何荧光。这种光的波长通常大于激发颜色。它可以是带通滤光片或长通滤光片。

3. 二向色分光镜：一片玻璃组件，与显微镜的光路成45度角。这种具有反射一种颜色 (激发光) 而透射另一种颜色 (发射荧光)的独特能力。目前的二向色分光镜具有非常高的效率，激发光的反射效率高于95%，发射光的透射效率约为95%。这是一个巨大的进步。二向色分光镜玻璃(称为基片)通由低自体荧光材料构成，如UV熔融石英。大多数显微镜具有一个滑块或转台，可以容纳两个到四个滤光块或更多。必须注意，各滤光块中的滤光片是相互匹配的一套组件，应当避免混用滤光片和分光镜，除非知道各滤光片组的全部光谱特性。

我们经常用U、B和G等颜色激发光名称来简单描述滤光片组，但当涉及到用于非常见染料和探针的特殊滤光片组时，这些就不能满足了，这时一些用于更精确描述滤光片的参数的信息是必须的。滤光片有带通和长通之分，人所感知的荧光颜色同时取决于带宽和特定波长。

以下我们简单介绍一下荧光滤光片中的一些术语：

带通滤光片用中心波长 (CWL) 和带宽 (FWHM) 表示。中心波长(CWL)为50%峰值透射时波长的算术波长(纳米)平均值。FWHM为50%峰值透射时（全高半宽）的带宽。长通滤光片(LP) 用50%峰值透射时的开启或截止波长表示。

滤光片透过率指得对目标波段的透光能力，用百分比来表示，透射率越大，代表透光能力越好。最直接的好处就是有效增加荧光图像绝对亮度，保证样品被充分探测到。

滤光片衰减水平（也称为截止深度）一般用光学密度（OD）单位来表示：OD=-log(Transmission)，指截止范围内的波长所对应的透过率，用来描述滤光片截止程度，透光率想要达到0是不可能的，只能让滤光片的透过率接近于零，才能够更好的截止不想要的光谱。

荧光染料发射荧光亮度相比于激发光亮度的微乎其微，二者共存于测试样品中，我们要检测到荧光信号，需要把较强激发光充分截止到低于荧光亮度的水平。为提高荧光检测准确度，通常需要将隔离度提高到OD5以上，才能得到较好的成像效果。对于一些弱荧光成像领域（如荧光原位杂交）则需要OD6甚至以上水平的滤光片。

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