如何正确选择显微镜相机

显微镜涵盖许多应用，其中包括从生命科学的基本应用到高度发展成熟的技术，使用特定的显微镜相机就可以检测和定位数量极少的光子或单个分子。

在选择适用于显微镜的相机时，既要考虑特定的芯片属性和相机的有关方面，也要考虑科学、医疗或工业领域中所需应用的需求，您需要在这两者之间达到平衡，这一点非常重要。

靶面尺寸和分辨率

显微镜相机靶面尺寸往往越大越好，但随着靶面尺寸的增加往往会导致总成本增加。

显微镜相机最终的光学分辨率取决于光电二极管的数量和它们相对于显微镜光学透镜系统投射到成像阵列表面上图像尺寸的函数所决定，当前可用的CCD阵列随着尺寸的变化，从几百至数千像素。在显微镜这一类受限于衍射的光学仪器中，当使用数值孔径为1.4的物镜时，在平均可见光波长（550纳米）处的光学分辨率的阿贝极限为0.2微米。在这种情况下，根据奈奎斯特采样定律，当像元尺寸大于21μm的一半，即11μm时，相机无法分辨出相距21μm的两个物体；当像元尺寸小于11μm时，可以分辨。尽管CCD成像传感器中更小的光电二极管可以提高空间分辨率，但同时它们也限制了设备的动态范围。

在用显微镜观察时，图像通常由光学系统投影到探测器表面，该探测器可以是人眼的视网膜或者电图像传感器。为了优化所得到的图像的信息内容，探测器的分辨率必须与显微镜的分辨率紧密匹配。

由于芯片在成像系统中发挥关键的作用，因此在选择芯片时充分考虑特定的性能规格是非常重要的

黑白或彩色相机

黑白相机由于其量子效率更高，业界青睐于将它用于荧光应用。彩色相机的量子效率低于黑白相机——导致出现这种差异的技术因素在于彩色相机中每个像素上的拜耳微型滤色片只能让特定的波长通过。这种过滤机制是为了使用“去拜耳化”的过程来计算图像的颜色信息。由于滤色片会阻挡一定量的光，因此到达像素的光子反应区域的光子会有所减少。除了芯片上的拜尔滤色片结构外，彩色相机中的红外截止滤光片也起到限制光线通过的作用，因为它还可阻挡约650 - 700 nm以上的光线。

通常，我们会使用黑白相机在多张单独图像中制作出具有多个荧光标记的图像，以便用于进行特定的检测以及共定位目标分子。通过不同的可选光源和滤光片组，可以为所用的每种荧光基团提供正确的荧光激发和发射波长组合。但是，某些应用可能会要求仅使用一台相机在一台仪器内进行彩色成像和荧光处理。如果荧光应用对灵敏度的要求不是太高，这个要求是可以实现的。

全局快门和滚动快门

CCD芯片只有全局快门一种快门类型，而CMOS芯片具有两种类型：全局快门和滚动快门。能否选择正确的芯片会对成像质量带来重大的影响，在目标物体会移动时尤为如此。在滚动快门芯片中，像素是逐行进行曝光的。因此，在接连的两行像素采集图像的间隔时间内，如果物体改变了位置，那么采集到的两个像素行就会产生图像偏斜的现象，造成图像的空间结构失真。但是，滚动快门芯片有一个技术优势：由于其像素中的电子部件较少，因此在读取过程中的噪声更低。与之不同的是，全局快门芯片会同时对所有像素进行曝光。在这种情况下，不同像素行的曝光之间不存在时间差，因此在物体移动时就不会导致空间结构失真。

灵敏度和动态范围

在仔细研究图像的成像质量之前，非常重要的一点是要先确保系统有足够的灵敏度来采集荧光信号。根据不同应用的实际情况，荧光信号的强度可能非常弱。我们应将灵敏度理解为要生成能与噪声区分开来的信号所需要的最小光量。量子效率(QE)是一个重要的数值，它描述来自光源的入射光子数量与像素所生成的电子数量之间的比值。这个比值取决于波长，为了获得最佳效果，特定芯片的光谱应与应用中荧光基团的发光光谱保持一致。量子效率越高，所产生光子的数量越多，使得曝光时间可以相应缩短，那么荧光基团被光漂白的机率就越低，并且还可能提高整体的成像速度。

通常，光源具有一系列广泛的光线强度也是有益处的，这样通过一次曝光就能解决问题。满井容量在这里也是密切相关的，这个概念描述的是每个像素曝光一次可以产生的最大电子数。满井容量越高，在像素饱和之前可以采集到的光线就更多，从而减少了由于像素饱和而要再次进行曝光的情况。

动态范围则是将产生真实信号所需的最大电子数与最低电子数相结合，它描述的是相机测量和区分不同光照等级的整体能力。

成像质量和噪声

噪声是指真实信号值和测量系统所产生值之间的偏差。在特定的光照等级下，信噪比(SNR)可用于量化成像系统的整体噪声水平，它是一个用于比较相机的通用参数。信噪比越高，成像质量就越高。在成像过程中，某些噪声类型几乎很难通过相机技术来减少，例如光子噪声/散粒噪声，因为它们是由光子本身的物理性质而引起的。但是，其他会影响成像质量的噪声类型则会显著受到芯片本身和相机技术的影响。近年来，在成像质量和性能方面，现代CMOS芯片已经超越了以前的CCD技术。读取噪声（或颞暗噪声）是每次触发快门时加到信号中的噪声，用单位“e¯/像素”来表示。现代CMOS芯片的读取噪声可低至2e¯/像素。

当曝光时间增加时，另一个与荧光应用相关的噪声源会变得非常重要，这种噪声是由暗电流引起的。暗电流是在曝光期间出现的电子泄漏，用单位“e¯/像素/秒”来表示。一般而言，暗电流会随着温度每升高7°C而翻倍

散热

芯片的温度对暗电流有至关重要的影响，会导致信噪比和成像质量变差，在光信号较弱且曝光时间较长时尤为如此。这意味着相机散热很重要，但这在荧光成像中并非绝对必要。由于散热措施对系统成本有显著影响，因此大多数相机并没有采用主动散热措施，这对于荧光信号良好的应用而言已经足够。但即便如此，这些相机中的设计也会影响芯片温度。所以，应该通过低功耗的模式来操作相机以避免设备发热。此外，还应通过内部硬件设计以及将相机安装在另一个散热载体上来有效地将热量传输到外部。

可以使用热电元件（珀尔帖效应）主动为芯片散热，通常可借助集成风扇将珀尔帖元件产生的热量排散到外部。当元件的温度低于环境温度时，风扇还有助于防止出现冷凝水。如果需要避免在系统中出现振动（可能由风扇引起），某些相机还可以支持水冷。

总结

关于如何正确选择显微镜相机，这里总结几条建议：

1. 第一个关键点是选择合适的显微镜，能够捕捉你要看的样品，然后是选择与之匹配的相机。如果物镜的光学分辨率低于你要观察的结构，那么任何相机都帮不上忙。

2. 我们可以根据传感器类型来选择相机，但不是唯一的办法。相机列出了许多参数，最重要的三个参数是：灵敏度、分辨率和速度，可根据需求进行选择。选择分辨率是需要将相机像元和光学分辨率进行匹配，在匹配的同时尽量选择像元较大的相机。如果你需要进行荧光成像，量子效率和读取噪声是决定相机灵敏度的两个关键变量。因此，在选购时需要考虑信噪比（SNR）。

3. 在实际选型中，不同类型的相机对制冷的要求也不尽相同：

①. 对于EMCCD相机，像素尺寸通常较大（常见的为13-16μm），每个像素上产生的暗电流本就较多，而且EMCCD中的暗电流还会和信号一起被增益放大，所以用制冷压制EMCCD相机的暗电流产生尤其重要。因为这些原因，主流的EMCCD相机制冷温度都在-50℃以下。

②. 而对于sCMOS相机，不仅像素尺寸会较小一些，也没有额外的增益，所以对制冷的要求就相对低一点。

4. 在信号较弱的荧光成像中，来自信号的散粒噪声较小；而暗电流的散粒噪声（即暗噪声）在当前的高端科研相机都是很低的，在曝光时间1s这个量级甚至更短的时候，暗噪声通常可以忽略；此时读出噪声就成为特别需要考量的因素了。对于同样的芯片，读出噪声的大小与读出速度有关，无论对于CCD相机还是sCMOS相机，读出速度越快，读出噪声越高。而sCMOS相对于CCD的一个核心优势，就是高速读出时依然能够保持极低的读出噪声。

案例

近期华中某国家重点实验室需要一台倒置荧光显微镜，我们工程师了解到客户主要用于拍摄细胞，偶尔也会用来拍摄组织染色切片，细胞具体荧光都是比较常用的染料，荧光也比较亮，不需要长时间曝光，所有倍数均有拍照需求，我们工程师综合客户的需求推荐了浩康生物倒置荧光显微镜HIF2000+高分辨率荧光显微镜相机HS2000E配置的高性价比方案，HS2000E采用sCMOS芯片，相比CCD具有更低的读出噪声和更高的性价比，经过试用该配置方案完全满足客户需求，并赢得了客户的认可。

荧光显微镜相机HS2000E

广州浩康生物科技有限公司