如何高效进行线虫观察

40多年来，秀丽隐杆线虫一直被用作神经科学、发育和分子生物学以及遗传学的模式生物。它是第一个对其整个基因组进行测序的多细胞生物，并且直到现在，它也是世界上唯一被完整绘制出神经网络的生物。秀丽隐杆线虫中的大量基因可以以与哺乳动物相似的方式发挥作用。秀丽隐杆线虫基因组中大约 1/3 的基因与某些人类基因同源，因此，该线虫可用作研究人类相关疾病的模式生物。线虫在实验室中培养非常容易和快速，通常保持在略低于室温 (15–20 °C) 的温度。成虫长约 1 毫米，直径小于 75 微米。它们保存在琼脂平板上，即培养皿内的琼脂凝胶，以细菌（大肠杆菌）为食物。

线虫的常规实验室工作有几个常见步骤：
1. 挑选线虫；
2. a） 转基因：将转基因显微注射到线虫中以修改其基因组；b） RNA干扰（RNAi）：将双链（ds）RNA引入线虫以抑制基因表达；
3. 筛选：评估线虫以检测成功的 RNAi 或转基因；
4. 用各种方法研究线虫的分子生物学、生物化学、遗传学；
5. 线虫的记录或功能成像，通常使用共聚焦或复合显微镜完成。

首先，必须选择和挑选线虫，然后是基因或蛋白质表达的操作，然后是一段时间的线虫繁殖。然后根据表型区分线虫，以找到对应特征的线虫。如果这些线虫太少，可能会重复前面的步骤。当有足够数量的具有感兴趣特征的线虫时，它们将被再次挑选、固定，最后进行功能成像。上面显示的工作步骤不一定按序号顺序完成。

一般线虫培养、挑选、筛选虫等时需要考虑的几点：
a. 每个平板中的琼脂量相同（高度相同）保证更换琼脂平板时避免重新聚焦；
b. 琼脂上的细菌（食物）浓度更低保证获得更清晰的线虫显微镜图像
c. 具有薄琼脂层且无蛋白胨可减少线虫成像板的荧光背景（自发荧光）
d. 良好的对比度对透射光可将线虫与琼脂区分开来
e. 良好的荧光信噪比 (S/N) 和暗背景可检测更微弱的荧光信号以获得更好的图像结果
f. 当以更高的总放大倍数（60 倍以上）对线虫成像时，确保良好的对比度和高分辨率。

在挑选合适的线虫并准备它们进行遗传或生化分析时，通常使用体视显微镜选择线虫并用小铂丝或睫毛挑选。然后，为了通过显微注射在线虫的性腺中进行基因改造，将它们放置在载玻片上的一个小的干燥琼脂垫上。

明场中的线虫筛查

使用多个体视显微镜可以实现对线虫的有效筛选以提高数量。 配备灯架或小型照明底座的浩康生物HZ6100常规体视显微镜非常适用于线虫筛查。当与辅助物镜一起使用时，它可以实现更高的放大倍率和分辨率。由于其紧凑的设计，HZ6100在实验室中占用的空间也更少。 使用这些显微镜可以轻松制作具有高对比度的线虫图像，即使在低放大倍率下也是如此。对于教学人员来说，它们也是特别好的解决方案。

下面列出了在使用HZ6100在明场中进行线虫筛查的不同优势。
★由于有足够的空间同时容纳多个琼脂平板，因此简化了标本处理，最大限度地减少了平板意外掉落的可能性；
★用于取虫、显微注射等操作，有足够的空间让用户的手在物镜周围和下方工作；
★学生课程的干净设置，因为没有外部灯、电缆，也没有可能从底座上掉下来的设备；
★由于居中 LED，标本成像具有良好的对比度和均匀的照明；
★不使用时易于存放，因为整个显微镜装置很容易放在壁橱架子上。

浩康生物 HZ7100体视显微镜也可以实现高效的线虫筛查。 HZ7100有一个共同的主物镜 (CMO)，因此没有倾斜的焦平面，双眼的整个视野都清晰对焦。 此外，该系统是模块化的，允许您非常快速地灵活添加、交换或更换组件。如果需要多个用户同时观察标本图像，并记录高分辨率图像以供报告，则可以安装数码相机。例如，具有630万或更多像素的相机HS600E/HS2000E可以生成高清 (HD) 实时图像和录制图像。

转基因、显微注射和 RNAi

有一些方法可以改变线虫的基因/蛋白质表达。通过对线虫进行显微注射来进行稳定和瞬时的基因修饰。 两种主要方法是：转座子，也称为跳跃基因，或CRISPR/Cas9系统。CRISPR 的转基因产量较低，需要一个世代周期进行选择，但转基因插入更稳定。转座子方法效率更高，产量更高，需要注射的线虫更少，但转基因整合到基因组中的位置并不总是很清楚。

一旦将线虫放在载玻片上的干琼脂垫上，重要的是要快速工作，否则线虫可能会在操作过程中干燥并死亡。为了减缓线虫的干燥，通常它会被油覆盖，例如卤化碳或石蜡。通常，显微注射应在 5 分钟内完成。将带有琼脂垫的载玻片放在倒置显微镜的载物台上，找到一条线虫，并将转基因 (DNA) 注入远端性腺。

然后用恢复缓冲液覆盖线虫，用铂丝或睫毛挑起并放置在单独的琼脂板上进行进一步培养和繁殖。此工作步骤通常在配备微分干涉对比 (DIC) 或集成调制对比 (IMC) 照明的手动倒置荧光显微镜上执行，例如 Leica DMi8或浩康生物HIF2000。强烈建议在显微镜下设置抗震装置以获得更高的产量。

对于显微注射针的精确定位，使用高精度3轴油机械手是实用的，例如来自 Narishige Instruments 的机械手

RNA 干扰 (RNAi) 用于在翻译水平上改变蛋白质表达。它是通过用表达双链 (ds) RNA 的转基因细菌喂养线虫来实现的。线虫摄取 dsRNA，它进入线虫的所有细胞（神经元除外），经过细胞生化处理，然后产生短干扰 (si) RNA。一旦存在于细胞中，siRNA 就会改变蛋白质表达。

转基因线虫育种及荧光筛选

显微注射后，线虫进一步培养，下一代用于实验。线虫保持在 20°C 以进行繁殖。必须避免线虫干燥，因此琼脂平板通常存放在塑料盒中。要获得大量的线虫，第二种可能是在锥形瓶中进行液体培养。

大约5条线虫足以进行蛋白质印迹分析（识别蛋白质）。然而，差分梯度离心需要 10万条线虫才能按密度分离细胞器和蛋白质。

由于转基因通常与绿色荧光蛋白 (GFP)结合，因此可以使用荧光体视显微镜对其进行选择。其他荧光标记如 DsRed在高表达水平下可能有毒，因此通常选择 GFP 标记。

使用明场定位线虫，检查荧光信号，然后挑选进行其他实验。对于成像，通常首选较年轻的线虫，因为较老的线虫通常表现出更高的自发荧光，尤其是在肠道中。将选定的线虫放在特殊的小琼脂板上，不含蛋白胨和细菌，以最大限度地减少自发荧光。琼脂层通常非常薄以进一步减少自发荧光。使用浩康生物HZF7000/HZFX800体视荧光显微镜，可以对线虫进行高效荧光筛查。

荧光筛查的重要考虑因素
★为了获得最高的对比度和分辨率，选择合适的底座；
★选择很少产生或没有荧光成像的背景光“噪音”的底座；
★使用带有双面镜凹面的底座时，在高倍率下可获得更好的对比度和更高分辨率的图像。
★使用带有外部光源的底座时，避免在不需要时加热线虫。
★对于高自发荧光的情况，降低荧光激发强度会增加信噪比。在许多情况下，来自线虫的荧光信号是最大的，并且不能增加更多，但背景总是可以。

功能成像
正置共聚焦和荧光显微镜，例如HF3000正置荧光显微镜，通常用于线虫的成像和记录以获得亚细胞的高分辨率图像和大分子结构。

对于共聚焦成像，线虫表达荧光蛋白，即 GFP、红色荧光蛋白（RFP、mCherry 或 DsRed）、黄色荧光蛋白（YFP）或青色荧光蛋白（CFP）。

线虫位于板中琼脂层的顶部需要正置共聚焦和荧光显微镜。线虫移动相对较快，所以它们通常被药物Levamisol麻醉，然后将盖玻片放在它们上面，以便通过液浸物镜进行观察。幼虫阶段的幼虫对光非常敏感，因此使用共聚焦共振扫描仪，由于停留时间短，可以将光毒性问题降至最低。共振扫描仪允许对线虫幼虫进行长期观察，而不会造成明显的损坏

总结

线虫的常用方法涉及使用体视显微镜和荧光显微镜等多个工作步骤。线虫实验室的需求可能会有所不同，可以使用多种仪器配置来解决工作步骤中的特定任务

以下是常用显微镜解决方案的列表:
一、线虫挑选通常使用普通体视显微镜（如浩康生物HZ6100）进行，使用产生高对比度的透射光底座；
二、转基因显微注射是通过倒置荧光显微镜（如浩康生物HF3000）实现的，使用显微操纵器定位针头和 DNA 注射器；
三、荧光筛选可以使用体视荧光显微镜（如浩康生物HZF7100 或 HZFX800）；
四、使用透射光底座实现非常好的对比度；
五、明场筛选通常使用普通主物镜 (CMO) 体视显微镜进行（如浩康生物 HZ7100）；
六、功能成像，即用于细胞分化、细胞凋亡、衰老、神经元活动等研究的转基因线虫的表征，是通过正置荧光显微镜或共聚焦显微镜完成的；
七、固定的线虫也可以使用更高性能的荧光体视显微镜（如浩康生物 HZF7100）和透射光底座；为了对线虫胚胎进行成像，建议使用共焦共振扫描仪以实现低光毒性；对于教室、教学实验室和培训，显微镜设置要求可能与研究实验室不同。

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