循环肿瘤细胞（CTC）

一、什么是循环肿瘤细胞 (CTC)

循环肿瘤细胞 (CTC) 是从原发性肿瘤脱落到血液系统或淋巴系统并在血液循环中携带到全身的细胞。CTC可以渗出并成为远处器官中额外肿瘤（转移瘤）随后生长的种子，这种机制是造成绝大多数癌症相关死亡的原因。CTC 的检测和分析可以帮助早期患者预后并确定适当的定制治疗。

二、循环肿瘤细胞 (CTC)的发展历史

1869年，Thomas Ashworth首次在一名患有转移性癌症的男性血液中观察到了CTC，将循环细胞的形态与来自不同病变的肿瘤细胞进行彻底比较后，Ashworth 得出结论：“有一件事是肯定的，如果它们 （指CTC）来自现有的癌症结构，它们一定已经通过了大部分的肿瘤细胞。循环系统到达健全腿的内隐静脉”。

CTC在现代癌症研究中的重要性始于 1990 年代中期，当时证明 CTC 存在于疾病的早期阶段。Paul Liberti 发明的采用铁磁流体（胶体磁性纳米粒子）和高梯度磁选机的精密灵敏磁分离技术使这些结果成为可能。从那时起，各种其他技术已应用于 CTC 计数和鉴定。

现代癌症研究表明，CTC 来源于原发肿瘤的克隆，证实了 Ashworth 的说法。为理解CTC 的生物学特性所做的重大努力已经证明循环肿瘤细胞在癌的转移扩散中起着关键作用。此外，高度敏感的单细胞分析表明，在单细胞水平上，蛋白质表达和蛋白质定位存在高度异质性，CTC 反映了原发性活检和转移部位的变化。

三、循环肿瘤细胞 (CTC)的优势

CTC或液态活检的检测与传统组织活检相比具有几个优势。
1. 它们是非侵入性的，可以重复使用，并提供有关转移风险、疾病进展和治疗效果的更多有用信息。例如，对癌症患者血液样本的分析发现，随着疾病的进展，CTC 检测有增加的倾向。
2. 进行血液检测既简单又安全，并且随着时间的推移可以采集多个样本。相比之下，实体瘤的分析需要侵入性程序，这可能会限制患者的依从性。
3. 随着时间的推移监测疾病进展的能力可以促进对患者治疗的适当修改，从而可能改善他们的预后和生活质量。预测疾病未来进展能力的重要方面是消除在重复 CTC 计数低且不增加时进行手术的需要；避免手术的明显好处包括避免与癌症手术的先天致瘤性相关的风险。

四、循环肿瘤细胞 (CTC)的特征

CTC分为不同的类型：上皮型、间质型和混合型。他们的恶性程度差别很大，手术治疗可将原发肿瘤病灶铲除，但之前释放的CTC仍残留在血管中，手术治疗后通常会配合药物治疗，大部分残留的CTC会受到药物和免疫系统的攻击而被杀死，但是有一部分CTC特别是间质型CTC有很强的耐药性，他们能躲避药物和免疫系统攻击存活下来。存活下来的CTC会随着血液循环另寻新的转移阵地，这也是肿瘤复发转移的原因。

循环肿瘤细胞（CTC）通常具有非典型性的细胞形态，一般比血液细胞，正常组织细胞体积大；细胞核大，不规则，细胞核质比高；不易发生变形。

在转移性疾病患者中，循环肿瘤细胞的频率约为每毫升全血 1-10 个CTC。相比之下，一毫升血液含有几百万个白细胞和十亿个红细胞。这种低频率与识别癌细胞的困难相关，意味着理解 CTC 生物学特性的一个关键组成部分需要能够从每毫升血液中分离出 1 个 CTC 的技术和方法，或者通过富集，或者更好的是通过无富集分析来识别所有 CTC 亚型都具有足够高的清晰度，以满足各种癌症类型患者的诊断病理图像数量要求。迄今为止，已在多种上皮癌（乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌）中检测到 CTC，临床证据表明，具有转移性病灶的患者更有可能分离出 CTC。

五、循环肿瘤细胞 (CTC)的富集

一般来说，外周血中CTC的数量极少，1ml血液中约有4×109红细胞、2×108血小板、6×106白细胞，而CTC只有1-10个，因此CTC的检测面临巨大的技术挑战。

常用的CTC富集方法包括非特异性富集法和特异性富集法。非特异性富集法主要是依据形态学原理，包括：密度梯度离心法、过滤法、细胞电学特征法等，这种非特异性的方法往往具有一定的局限性，如：富集效率低、灵敏度和特异性较低、易受细胞形态影响等。特异性富集法多数是依据抗原抗体原理，包括：免疫磁珠富集法、芯片法、纳米粒富集法等，其中免疫磁珠法又分为阴性富集（负选）和阳性富集（正选），常见的阴性富集法是利用耦连CD45抗体的磁珠吸附白细胞，在磁场作用下去除白细胞，富集CTC；阳性富集是通过偶联EpCAM抗体的免疫磁珠捕获EpCAM阳性的CTC，适用于EpCAM或CK阳性的CTC。

六、循环肿瘤细胞 (CTC)的分析与鉴定

利用免疫亲和或物理特性法可富集到CTC，接下来还需要结合有效的下游分析方法。一方面，由于目前CTC捕获技术不能保证百分之百的纯度，需要对所得到的细胞进行鉴定，以进一步确定CTC细胞的数目，以减少CTC数目判定的假阳性率和假阴性率。另一方面，在肿瘤的发生发展过程中，不仅CTC的数目在动态的变化，CTC所携带的分子标志物也在变化，通过对CTC表面标志物检测，能够反应肿瘤发生发展的动态变化，是研究肿瘤发生发展机制的有效策略，并能很好地指导临床治疗。常用的CTC检测技术如免疫荧光、PCR、FISH及高通量测序等。

1. 免疫荧光法（IF）: 实体肿瘤细胞一般均为上皮来源，细胞内会表达角蛋(cytokeratin, CK)或其他肿瘤标示物(如HER2)。借助免疫荧光染色，可对来自实体瘤CTC中的瘤标进行识别，从而达到检测CTC的目的。这也是目前检测CTC的最常见方法。缺点是在CTC形成过程的间质化(EMT)阶段，大量的CK会降解，从而在CTC检测过程中出现假阴性，为此需要其他肿瘤细胞表面标示物 (如 EpCAM、HER2、CA19-9 等) 染色作为补充，以提高 CTC 检出的阳性率。免疫荧光法是目前最常用的方法。

2. 荧光原位杂交（FISH）: 荧光原位杂交，是根据已知细胞内特异的DNA序列，以利用荧光标记的特异寡聚核苷酸片段作为探针，与细胞内的基因组中DNA分子杂交，检测该特异基因序列的存在与丰度。FISH技术与CTC结合，不仅可以检测CTC表面标志物，也可以检测CTC细胞内部的标志物及核型等

3. 反转录PCR: 提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用引物和逆转录酶将mRNA反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。结合RT-PCR可同时对若干个基因的表达进行检测。位点特异性PCR技术可用于检测CTC携带的驱动基因的突变情况。

4. 二代测序 : CTC数量少，直接进行二代测序难度大。需要将单细胞的DNA扩增后，再利用二代测序检查基因序列。但是，目前单细胞测序的技术仅仅停留在实验室阶段，未来向市场推广还有很长的路要走。而且由于肿瘤细胞的异质性，单细胞测序是否有代表性还需要更多的科学研究来证明。

七、循环肿瘤细胞 (CTC)的未来发展方向

CTC检测是对抗癌症的关键工具，在癌症早期诊断、治疗监测、复发监测和用药指导中起着关键性作用。“稀有性”是CTC检测最大的难点，如何从几亿个血细胞中精准捕获几个CTC细胞？富集效率极为重要。因此迫切需要开发一种更灵敏、更具特色、更简便高效的检测系统。CTCs 检测的临床实用性需要进行进一步的大规模的研究进行验证，但其多功能性和优势为癌症的诊断和预后提供了新的工具，相信在未来几年循环肿瘤细胞将大大促进精准肿瘤学领域的发展。

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