什么是相差显微镜
一、什么是相差显微镜
相差显微镜是常见的一种显微镜，在很多实验室中都可以见到，利用光线穿过透明样品时产生的相位差转换为图像中的振幅或对比度差的原理，主要是用来观察细菌，细胞等细胞结构的透明样品。因为它可以在自然状态下检查活细胞，而无需事先对细胞杀死、固定和染色的优点，相差显微镜可以高清晰度和高对比度地观察和记录动态的生物过程，可以用来进行细胞周期等方向的研究。
相差显微镜的出现得益于相衬显微技术的发明，相衬显微技术是显微技术的中的一个重大进步，它的发明人泽尼克也因此获得了1953年的诺贝尔物理学奖。
二、相差显微镜的原理
相差显微镜的核心是一个位于聚光镜孔径光阑位置的相差环板和位于物镜后方的相位板。首先光线从照明用的灯丝内的一点射出，由场透镜精确的聚焦在聚光镜处的相差环板的开放处。由于这个位置处在聚光镜的前焦平面，光线在通过聚光镜后将变成平行光。假设这两束光线在标本处不发生衍射，它们将平行的射入物镜，所有的平行光都会聚焦在物镜后方的相位板上。但实际上，部分光线通过标本以后部分光线将会发生衍射，为了完成调整相位的需求，需要调整物镜后方的相位板即可。相位板的另一个作用是将未被标本影响的光线减弱，用对中望远镜观察物镜后方的相位板，可见减光材料形成的暗环。
物镜后方的相位板由共轭面和补偿面组成，共轭面为环状，是直射光通过部分，通常涂有吸收光线的物质，补偿面位于共轭面的内外两侧部分，是通过衍射光的部分。
光线通过相差环板射入，通过聚光镜射出后形成平行的波阵面。当这些平面波碰到样本的时候，一些光在穿过标本时发生衍射，改变了它们和直射光之间的相位关系，新产生的球面波在从标本射出后相位将被延迟λ/4。注意到现在有两种类型的波，直射光和衍射光，它们之间存在λ/4的相差。在正相衬中，共轭面只镀有吸收膜，补偿面则镀有相位膜，这样直射光A仅被吸收，振幅减少，相位未被推迟；而衍射光B的相位则被延迟λ/4，使其与直射光的相位相差λ/2（λ/4+λ/4），在中间相平面上的合成波C的振幅等于两波振幅的差（引起相消干涉），这时样本要比背景暗（因为背景只有直射光，被吸收，振幅减少），这就是正相衬的效果。
相反在负相衬中，由于相位板的共轭面不仅镀有吸收膜，而且还镀有相位膜，除了吸收直射光使其振幅减小外，而且也把直射光的相位延迟λ/4，这样使直射光A与衍射光B维持同一相位，则合成波C等于直射波与衍射波振幅的和（引起相长干涉），因背景只有直射光的照明，而样本则比背景明亮。
这样就通过相差显微镜改变直射光或衍射光的相位，把人眼无法鉴别的相位差变成了眼睛能测量到达视网膜的光线能量强度振幅差（明暗差），在观察细胞的时候也就不会对细胞标本产生伤害。
三、相差显微镜的优势
相差显微镜可以观察未经染色的活细胞等样品，相对于其它对比增强技术，如DIC，相差显微镜不使用偏振光照明，因而可以观察双折射介质，如透过塑料培养瓶或培养皿进行活细胞观察，可以清楚观察到样品的内部结构（如细胞核），这在细胞学研究上特别有用。如和落射荧光技术连用，相差物镜可以透过约70%的激发光，优于DIC，所以相差往往作为辅助成像功能应用在荧光显微镜上。此外，相差套件的采购价位相对较低，使用调校也较为简单。
但是相衬显微技术存在一些固有的不足。由于必须使用环形光阑，启用相衬照明时聚光镜的数值孔径有所限制，所以相衬成像的轴向分辨率较低。另外，标本和背景折射率差异较大的分界处会出现明显的光晕，导致如细胞膜、细胞器外缘等位置的细节被遮蔽。
四、相差显微镜的应用
相差显微镜主要用于对透明标本的高对比度成像，如活细胞（通常在培养基中）、薄组织切片、光刻图案、纤维、乳胶分散体、玻璃碎片和亚细胞颗粒（包括细胞核和其他细胞器）。
另外相差显微镜广泛应用于临床中，新鲜液体标本中细胞和微生物的检查,尤其适用于活细胞检查。一般是取新鲜液体标本,加上盖玻片(如用油镜时,还需在盖玻片上滴加镜油)立即进行检验。如：血液学检验中用于血小板计数、血液中寄生虫检查和某些活细胞观察等；微生物学检验中用于不染色或染不上色的细菌、螺旋体、真菌孢子等的快速辨认,特别是对具有鞭毛、荚膜等特殊形态微生物的鉴别，还有尿分析中用于辨认新鲜尿中各种细胞和管型,特别是透明管型、白细胞、肾小管上皮细胞以及红细胞形态的分类等。
五、相差显微镜的使用方法
1.打开显微镜明场电源开关（“︱”为开，“O”为关）
2.将样品置于载物台上
3.将显微镜光路调至目镜观察位置
4.从低倍镜开始观察，调节到与镜头相匹配的相差环，荧光滤块调到空档的位置
5.调节透射光光强，调节焦距，找到预观察视野
6.依次换到高倍镜，（注意调节相差环）观察样品
7.拍照时将光路选择调至相机拍摄位置
注意：
1. 光源亮度和孔径光阑应适当调大，因为相差环板和相位板遮掉大部分光源；
2. 样品不能太厚，以5-10ｕｍ左右为宜，否则将影响成像质量；
3. 选取高品质载玻片和盖玻片，厚度等应符合标准；
4. 安装时应把每个相差环调节到最佳状态。
广州浩康生物科技有限公司